零背景pTOPO-TA克隆试剂盒，AT克隆连接试剂盒

Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit

零背景pTOPO-TA克隆试剂盒

hyyab83-20T

试剂盒组成、储存、稳定性：

－20℃储存，至少12个月。冰袋运输，1-2天置于室外常温不影响质量。

产品介绍：

本制品和传统的T4连接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬间（几秒钟-几分钟）、高效（接近100%）连接DNA片段的原理采用本公司独创的工艺制成。

1. 可以在瞬间（几秒钟-几分钟）完成A末端PCR产物连接。
2. 特制的新型载体质粒大小仅仅不到2kb，充分发挥了TOPO载体越小，可容纳片段越大的优势，最大限度提高了大片段连接效率；连接后质粒大小比传统载体小2kb以上，质粒越小，转化效率越高，极大的提高了各种片段连接后的转化子数量。
3. 采用氨苄抗性载体只需10分钟复苏时间，比卡那抗性载体1小时复苏时间缩短6倍。
4. 最快可以不用冰浴和热休克，室温5分钟内完成转化；无需1小时复苏，只需37℃10分钟复苏便可以涂板。从连接到涂板最快只需15-20分钟。
5. 自杀基因零背景原理，无自连假阳性，无需繁琐蓝白斑筛选和菌落PCR筛选。大部分情况下随机挑一个克隆便是有插入的（接近100%）。
6. 连接长片段能力远超传统TA克隆载体，可连接长达10kb片段（例如连接5kb片段，也可能达到挑10个菌落，至少8个是有插入的效果），是新一代世界领先的简单、快速、零背景免筛选的TOPO TA克隆载体。

注意：测序只能采用 M13F/M13R通用引物测序（见后面图谱），但是不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物测序。菌落PCR可使用和测序相同的引物。

操作步骤：

1. 连接反应的准备：

PCR引物使用正常设计的引物即可，不需做任何改变（不能用磷酸化引物）。使用能在PCR产物末端加一个突出的3’-A的酶系列扩增（如Taq、LA Taq、F8 Mix、Taq Mix）。 PCR产物一般建议胶回收纯化（货号：DR01)，这样可以避免后续可能的问题。如果PCR产物仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体，也可尝试直接进行连接反应。如果是以质粒为模板的PCR产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。

2. 连接反应：

1. 室温（25℃-37℃）设立10ml连接体系（建议用0.2ml PCR管，PCR仪器控温）： 

加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（25℃-37℃）进行。

注：如果使用5ml体系连接，各成分按照比例减半使用，使用次数可以加倍。

不同大小插入片段的推荐用量（注意过量太多了，反而导致转化子减少）：

2. 室温（25℃-37℃）连接5分钟（建议置PCR仪器上控温）。

本载体推荐室温（25℃-37℃）5分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到10-15分钟，温度可选37℃，可显著增加转化子数量。

3. 连接产物置于冰上备用。立即接标准的感受态转化步骤或者快速转化步骤。

3. 快速转化：

1. 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰浴中，解冻融化（约1-3分钟左右）。
2. 立刻加入5ml连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，用手拨打离心管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰浴放置5分钟。
3. 42℃水浴热激60秒，迅速放回冰浴静置2-3分钟，该过程不要摇动离心管。

注意：此步骤首选建议42℃水浴60秒热激。但是根据我们的经验，大部分商品化的TOP10和DH5a感受态细胞此步骤也可将离心管置于室温（˃22℃）进行，时间不需十分准确，夏季或室温较高时，可放置5-8 分钟左右；如果室温较低，可延长时间至8-15 分钟左右。有经验的客户可以根据具体情况尝试无热激转化。

4. 加500ml LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 200 rpm振荡培养10-20分钟。

根据我们的经验，一般可以直接将培养基（如从冰箱取出温度低，应事先置37℃温箱回温至22℃-37℃） 加入到感受态细胞的1.5 ml 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。

一般商品化的感受态细胞不超过2kb插入片段情况下，热休克后10-15分钟复苏可以得到足够多转化子，如果使用实验室自制的感受态效率低、或者转化子少、插入片段长的情况下可以提高复苏时间到30-60分钟以得到更多的转化子。

5. 取100-200ml菌液涂板(培养板含氨苄青霉素100mg/ml），培养过夜。（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000 rpm 离心1 min，吸弃掉部分上清，保留100ml，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）

4. 转化子的筛选鉴定：

    本制品采用自杀基因零背景原理，无插入自连的细菌会自杀无法生长，因此几乎没有假阳性，一般情况下，可以达到所见即所得，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超过2-3kb的情况下可以不用菌落PCR鉴定,直接挑1-2个菌去测序。

1. 一般本公司TOPO载体阳性率非常高，所以菌落生长正常，数量也不是太少的情况下建议省略菌落PCR/菌液PCR鉴定直接去测序。注意测序引物不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物测序。
2. TOPO载体的菌落PCR结果容易出现假阴性。因此在使用菌落PCR鉴定的情况下，如菌落PCR结果阳性，一般可以相信此结果。如结果是阴性，或者显示扩增出大小和预期不符合，一般不可相信，要考虑到菌落PCR结果假阴性的可能。需要进一步提取质粒电泳跑大小，或者酶切鉴定来确认。
3. 用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，插入片段较大的情况下，直接跑电泳看质粒大小就直接能鉴定出有插入的质粒，还可用EcoR I/Ecor V单酶切释放插入片段或用其它合适的酶切，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。
4. pTOPO-TA载体图谱：

5. pTOPO-TA载体

   通用M13测序引物序列：

   M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT     M13R: CAGGAAACAGCTATGACC 

   注: “M13通用引物” 有多种不同的序列，且个别引物合成公司默认的M13引物与此载体所用的M13序列有差异，合成使用前务必先核对序列

6. pTOPO-TA载体多克隆位点序列：

7.