Sybr Green Realtime PCR Master MIX （通用型Qpcrmix）
-
Sybr Green Realtime PCR Master MIX （通用型Qpcrmix）
HAF168-5ml 1.25ml*4
产品组成、储存、浓度：
储存：－20 ℃ 避光保存至少12个月。经常使用，解冻后可置于4˚C保存至少6个月，避免多次冻融。
制品说明：本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用2 x预混试剂。 采用艾德莱特异的新型双封闭HotStart Taq DNA Polymerase ，配以特异的双阳离子缓冲液和多种特异性促进因子，增强特异性，减少引物二聚体的形成，使得结果更加准确可靠。本制品已加入特殊的通用ROX参比染料，适应于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。
注意事项：
- 本制品已加入特殊的通用ROX参比染料，具有高通用性，可用于各种仪器。无论是需要添加ROX的仪器（如ABI 的各种需要高ROX或者低ROX机型），还是不需要添加ROX的仪器（ 如Roche Light Cycler、Bio-Rad CFX96等机型），均适用于本制品。
- 使用前请轻柔上下颠倒以混匀Master Mix，请勿vortex避免产生过量气泡，影响定量结果。Master Mix经混匀短暂离心后即可使用。。
- 本制品含SYBR Green I 强光下易分解，降低敏感度，使用时避免长时间强光照射本制品。
- 建议在冰上配制PCR反应液，再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
建议PCR条件(以25，50 μl反应体系为例，反应液配制请在冰上进行)
Components
Volume（20 μl）
Volume（50 μl）
Final Concentration
2 x Dual SYBR qPCR Mix
10 μl
25 μl
1×
DNA Template
1 μl
2 μl
as required
Forward Primer (10 μM)
0.4 μl
1 μl
0.2 μM each
Reverse Primer (10 μM)
0.4 μl
1 μl
0.2 μM each
ddH2O to final volume
20 μl
50 μl
Not applicable
PCR 循环（二步法）
1 95℃ 2 min9
2 5℃ 15 sec
3 60℃ 30-34 sec
step 2-3,40 cycles
Dissociation Stage
PCR 循环（三步法）
1 95℃ 2 min
2 95℃ 15 sec3 60℃ 15-20 sec step2,3,4 40 cycles
4 72℃ 20-30 sec
Dissociation Stage
说明：本制品兼容性强，适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪，绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说，二步法扩增特异性高，三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增；若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。
荧光定量PCR实验常见问题和解决方案
Q1：无信号值出现
A1：
- 反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
- 检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
- 引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。
- 引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
- 模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
- 模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Q2： CT值出现过晚
A2：
- 扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
- PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
- PCR产物太长。一般采用100-150bp的产物长度，一般不超过500bp。
Q3：标准曲线的线性关系不佳
A3：
- 加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
- 标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
- 引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
- 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
Q4：阴性对照也出现明显扩增
A4：
- 反应体系或者水被污染：更换新的Mix或者水重复试验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
- 引物二聚体的出现：一般在35循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合融解曲线进行分析。
