微量His标签蛋白纯化试剂盒

微量His标签蛋白纯化试剂盒

Hyysbtb09-5ML

规格型号：5T/10T

保存条件：试剂室温保存，Ni-Agarose 介质 4℃保存，有效期 2 年。

微量His标签蛋白纯化试剂盒

产品组成：

产品说明：

本试剂盒是基于 Ni 亲和层析的蛋白质纯化方法进行 His 标签蛋白纯化的试剂盒；变性和非变性条件均可使用，耐受高浓度变性剂（8M 尿素和 6M 盐酸胍），适用于纯化 His 标记的包涵体蛋白，载量高（纯化介质载量为 20-30mg His 标记蛋白质/mL 介质），并且洗脱的样品可直接用于 SDS-PAGE 凝胶电泳。

微量His标签蛋白纯化试剂盒

自备试剂:

1*PBS

操作步骤如下：

一、装柱

1、将 Ni-Agarose 介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中。

注意：介质用量需要根据 His 标记的蛋白产量决定，请根据实验需要取适量的 Ni-Agarose 介质加入层析柱。（10-20mL 表达菌液，建议添加填料体积 500uL；30-50mL 表达菌液，建议添加填料体积 1mL；填料总体积不建议超过 1mL，避免出现柱子堵塞情况）。

2、用 4 倍柱体积的 1*PBS 洗柱。（或纯化水均可）

微量His标签蛋白纯化试剂盒

二、样品处理（以 50mL 表达菌液为例）

12000 rpm，4℃，离心 20 min，收集 50 mL 表达菌液，弃上清；1*PBS 重悬，4℃，离心 20min，沉淀放冰上待用或放-80℃备用。

1、沉淀取 10 mL 非变性裂解液（Binding Buffer A）重悬，进行超声破碎。（推荐添加 PSMF 蛋白酶抑制剂）

2、12000 rpm，4℃，离心 20 min。

3、分别收集上清、沉淀。His 标记可溶性蛋白在上清液中，上清过 0.45 μM 滤膜，防止堵塞柱子。His 标记包涵体蛋白在沉淀中，放冰上待用或-20℃保存。

三、纯化

A、His 标记的可溶性蛋白纯化

1、将上步得到的上清液上柱，待液体填满介质后，将层析柱底端的盖子盖上，让细菌裂解液和介质在常温结合 20min 后（若想获得更多目标蛋白，可将细菌裂解液和介质置于 4℃中结合过夜）取掉盖子，自然重力下让裂解液自然流出。

2、用 4 倍柱体积非变性裂解液（Binding Buffer A）洗柱。（可收集并保存穿透液，SDS-PAGE 电泳检测未被吸附的 His 标记蛋白）。

3、配置含不同浓度咪唑的洗脱液，将非变性洗脱液（Buffer 1）用非变性稀释液（Buffer 2）稀释成不同浓度咪唑的洗脱液，以确定 His 标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序以 3-5 倍柱体积洗涤并收集样品，SDS-PAGE 电泳检测 His 标记蛋白所在的区域。建议咪唑浓度梯度为：30、100、200、300、500 mM。

4、洗脱后，使用 10 倍柱体积的纯化水洗涤柱子，再用 5 倍柱体积的保存液平衡，最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下次使用。

B 、His 标记的包涵体蛋白纯化

1、将包涵体用 1* PBS 重悬两次，洗涤包涵体。将包涵体沉淀用 5 mL 包涵体溶解液（Binding Buffer B）重悬，置于摇床中，37℃，1 h 以使包涵体充分溶解。（4℃过夜效果更好；如果有未溶解的沉淀，建议采用 6M 盐酸胍溶解）

2、12000 rpm，4℃，离心 20 min，将溶解后的上清过 0.45μM 滤器。

3、将滤过液上柱，待液体填满介质后，将层析柱底端的盖子盖上，让细菌裂解液和介质在常温结合 20min 后（若想获得更多目标蛋白，可将细菌裂解液和介质置于 4℃中结合过夜）取掉盖子，自然重力下让裂解液自然流出。

4、用 3-5 倍柱体积包涵体洗涤液（Buffer 3）洗柱。（可收集并保存穿透液，SDS-PAGE 电泳检测未被吸附的 His 标记蛋白）

5、配置含不同浓度咪唑的洗脱液，将包涵体洗脱液（Buffer 3）用包涵体稀释液（Buffer 4）稀释成不同浓度咪唑，以确定 His 标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序以3-5 倍柱体积洗涤并收集样品，SDS-PAGE 电泳检测 His 标记蛋白所在的区域。建议咪唑浓度梯度为：30、100、200、300、500 mM。

4、洗脱后，使用 10 倍柱体积的纯化水洗涤柱子，再用 5 倍柱体积的保存液平衡，最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下次使用。

填料清洗： 见产品“ 镍-琼脂糖凝胶 6FF”，清洗及再生方法相同。

微量His标签蛋白纯化试剂盒

注意事项：1. Ni-Agarose 介质使用前混匀, 并于 4℃冰箱保存。

2. 蛋白酶抑制剂根据需求，需单独购买。