Y1HGOLD-pAbAi Yeast One-Hybrid Media plus Kit II (pAbAi)
-
Y1HGOLD-pAbAi Yeast One-Hybrid Media plus Kit II (pAbAi)
with ABA（金担子素）
酵母单杂互作全套试剂
产品规格:
Component 规格 Store
YPDA Medium 500 ml RT
SD/-Leu Broth 5L RT
SD/-Ura Broth 500 ml RT
酿酒酵母感受态制备及转化试剂盒 200T 按标签标注
金担子素 A(AbA)(进口) 1mg -20℃
一、酵母培养基说明书
(1) YPDA 培养基的配制
1.在1L 去离子水中加入相应量的YPDA，如需固体额外加入2%的 Agar，搅拌均匀;
2.调节 pH 至6.5，121℃高压灭菌15min;
3.避光、室温条件下储存灭菌培养基(固体冷却至50℃左右倒平板)。(2) SD类培养基的配制
1.在1L 去离子水中加入相应量的SD培养基，如需固体额外加入2%的Agar，搅拌均匀;
2.调节 pH 至5.8，121℃高压灭菌15min;
3.4℃冰箱避光储存已经灭菌的液体培养基(固体冷却至50℃左右倒平板)。注意事项:
1.在配制酵母缺陷培养基时，培养基会变色，由浅黄到深褐色不等，对酵母的生长不会产生严重影响。
2.葡萄糖高温灭菌会有碳化现象，控制好灭菌温度和时间，葡萄糖的微量碳化对实验并无太大影响。缺陷培养基的PH值在5.5-6.5范围内都是比较适合酵母生长的，此类试剂粉末的PH已经过调试，使用时只需要稍微调整即可。
二、酿酒酵母感受态制备及转化试剂盒说明书
(1)酵母感受态细胞的制备:(文库转化对应600ul 的诱饵感受态)
1.活化菌种。-80℃保存的菌种在YPDA固体培养基上划线，30C培养 2-4d。
2.挑取酵母单菌落接种到3mlYPDA液体培养基中，30°℃过夜培养。
3.第二天转接到含有30mlYPDA液体培养基的三角瓶中继续培养，等到OD600 到0.5-0.6范围内。收集细胞，4000rpm，离心5min，去上清。
4.沉淀用 30-50ml的无菌的去离子水悬浮。4000rpm，离心5min，去上清。
5.沉淀用 300μl 的 LiAc感受态制备液悬浮。
6.把酵母细胞悬浮液分装到1.5ml离心管中，每管分装100ul，用于转化一个质粒即一个反应。感受态细胞应现做现用或于4℃放置不超过 12h。
(2)酵母转化:
1.取一支无菌的 1.5mlEP管，依次加入预冷的目的质粒1-3μg，Carrier DNA5μl，100μl感受态细胞， PEG/LiAc 转化液 500ul，轻轻翻转混匀6-8次;
2.30°℃水浴30min，每10min轻轻翻转混匀6-8次;
3.每支加入 20ul 的二甲基亚砜;(用于提高转化效率)
4.42°℃水浴 15min，每5min轻轻翻转混匀6-8次;
5.12000rpm瞬时离心弃上清，每支加入1ml的YPD Plus 于30℃，200rpm 复苏1h;
6.12000rpm 瞬时离心弃上清，用100ul 0.9% NaC1重悬，涂板，30°℃培养 48-96h。注意事项:
1.Carrier DNA使用前需在沸水中煮沸5min，然后立即放在冰上，用后放在-20℃储存备用。
2.全程均要无菌操作。
3.12000rpm瞬时离心指离心速度升到12000rpm时立即停止离心。
三、金担子素 A (AbA) 说明书
1.加入 0.5ml过夜培养的酵母到50mlYPD培养基中;(配方:1L液体培养基含有10g yeast extract，20g polypeptone,20g D-glucose;固体培养基另外加入 2%琼脂)
2.30℃培养约 6h，测定OD660为1~2。使用二倍体时，测定OD660 为2~4;
3.1,000xg离心5min;
4.用 10mL SolutionA(配方:100mM Lithium acetate，10mM Tris-HClpH7.5，1mMEDTA)悬浮沉淀，1,000xg 离心 5min;
5.用 Solution A重悬沉淀，直到OD660 为150;
6.在管内分取 100ul细胞悬浮液，30℃培养1h;
7.加入5μg 载体(环状或线性 DNA)和150μg Carrier DNA(已经过100℃加热10min，并迅速冷却);注:pAUR101需使用线性DNA进行转化。使用环状DNA会降低转化效率甚至转化不成功。pAUR112 和 pAUR123 需使用完整的质粒 DNA转化。
8.加入 850μl Solution B(配方:取40g Polyethylene Glycol 4000溶于100ml Solution A充分溶解，需要现用现配)，轻轻混匀;
9.30℃培养 30min 后，42℃培养 15min;10.室温放置 10min;
11.5,000 rpm 离心 1min，用5mlYPD培养基悬浮沉淀;12.30℃培养 6h~过夜;
13.5,000~10,000 rpm离心，用1-10ml 0.9%NaC1悬浮沉淀;
14.在 YPD 选择培养基平板(含一定浓度的AbA，依菌株类型而定)上接种100μl细胞悬液。30℃培养3~4d 后转化完成;
15.挑取阳性转化子，和/或测定转化效率(以每微克质粒DNA转化的菌落数来表示)。
注意事项:AbA的最佳工作浓度因宿主细胞不同而有差异，可根据最低抑菌浓度(MIC)来确定。
